CRISPR/CAS是什么？

CRISPR代表"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"（成簇規律間隔短回文重復序列）。II型原核生物CRISPR“免疫系統”的發現，使得能夠開發簡單、易用、快速實施的RNA指導的基因組編輯工具。CRISPR首字母縮寫通常發音為“ crisper”。

CRISPR / CAS采用何種工作原理？

CRISPR通路在細菌中被發現，其功能很像免疫系統，可以抵御入侵的病毒和質粒DNA。來自入侵病毒的短DNA序列（間隔區）摻入細菌基因組內的CRISPR基因位點，并充當先前感染的“記憶”。再感染引發互補的成熟CRISPR RNA（crRNA）以找到匹配序列 — 其為CRISPR相關（Cas）核酸酶提供特異性，以在特定 “外源” DNA序列處形成雙鏈斷裂。

圖 1.基因組靶標位點
CRISPR CAS9采用何種工作原理？
為了創建這樣的工具，內源CRISPR途徑被簡化為兩個主要組分：Cas9核酸酶和指導RNA（gRNA）1-7。導向RNA是由crRNA和tracrRNA組成的雙組分系統。crRNA靶向待切割的雙鏈DNA，并且具有短的同源區域，允許其結合tracrRNA。 tracrRNA提供與Cas9蛋白結合的莖環結構。crRNA:tracrRNA雙鏈體被稱為gRNA。 Cas9核酸酶和gRNA形成Cas9核糖核蛋白（RNP），可以在整個基因組環境中結合并切割特定的DNA靶標。為了被RNP切割，靶必須具有兩個特定序列。首先，gRNA需要17-21個堿基的RNA至DNA同源性，這被稱為前間隔序列。 其次，Cas9蛋白需要有一個短的前間隔序列鄰近基序（PAM），以結合靶DNA（參見圖2）。 如果存在連接tracrRNA，并且在gRNA和基因組靶標之間存在足夠的同源性，則RNP切割靶DNA的兩條鏈，在基因組中的該位置處產生DSB。

圖 2.CRISPR / Cas靶向雙鏈斷裂的示意圖。

雖然細胞核中的功能性CRISPR是RNP形式，但作為分子工具的CRISPR的組件適合于各種遞送方法。 早期實驗成功地創建了嵌合單指導RNA或sgRNA，其將crRNA和tracrRNA組合成單個RNA鏈而不是天然存在的雙鏈體。 該sgRNA和Cas9 mRNA可以從單個質粒表達，用于直接轉染或包裝成用于慢病毒轉導的顆粒。 也可將重組Cas9蛋白與合成產生的crRNA和tracrRNA組合，以生成RNP轉染或顯微注射給胚胎。

靶向DSB形成后，細胞通常使用兩種DNA修復途徑中的一種來存活：非同源末端連接（NHEJ）或同源依賴性修復（HDR）。這些修復機制經常會出錯，導致在靶位置誘變，或者通過破壞編碼序列來功能性地失活或敲除基因（NHEJ），或者通過添加新的DNA序列來敲入特定的序列變化（HDR）。通過這種方式，CRISPR / Cas9系統能夠對染色體DNA進行的、可遺傳的修飾。此外，當Cas9核酸內切酶結構域失活并附著于其他效應分子以作用于基因組中的gRNA指定位點時，CRISPR系統可用作靶向遞送系統。 這將CRISPR系統功能擴展到基因激活和抑制。zui后，CRISPR系統可用于篩選。CRISPR / Cas9系統的基因敲除、基因敲入、基因激活或抑制、以及篩選這四種主要用途將在下面進一步討論。

基因敲除

當與靶向基因特異的gRNA一起共表達時，CRISPR / Cas9產生敲除細胞或動物模型。基因敲除的目的是通過破壞其在細胞中的表達來揭示基因功能。共表達的適當設計的gRNA指導Cas9切割靶序列，并在目的基因中產生DSB。然后可以通過三種方式中的任何一種實現基因敲除：1）細胞通過NHEJ修復斷裂，導致切割基因的開放閱讀框（ORF）內的隨機插入或缺失（“插入缺失”）；2）細胞通過HDR從用戶提供的模板修復斷裂，將特定的破壞性序列插入ORF中；3）一對gRNA產生兩個DSB，其位于基本編碼序列的側翼，導致其切除。

NHEJ是zui活躍的修復機制，但是容易出錯，并且經常引入移碼，導致過早終止密碼子和/或導致所得轉錄物成為無義介導的衰變（NMD）的靶標。移碼修飾可導致過早終止密碼子被引入轉錄物，阻止氨基酸鏈的關鍵部分被翻譯，導致異常短的無功能蛋白質。無義介導的衰變通過消除含有過早終止密碼子的mRNA轉錄物來減少基因表達中的錯誤。 理論上，當外顯子-外顯子連接復合物（也就是RNA剪接期間在外顯子之間的前mRNA鏈上形成的蛋白質復合物）在轉錄物被剪接后未被核糖體適當地去除時，這個監視途徑被激活。當外顯子-外顯子連接復合物由于上游移碼而保持結合時，轉錄物被指示降解，并且功能蛋白質從未被翻譯。這兩種途徑都有效破壞細胞中的基因功能。

基因敲入

CRISPR / Cas9也可用于引入或“敲入”新的DNA序列。常見的修飾包括引入單核苷酸多態性（SNP）、小標簽、loxP或更大的基因盒，例如熒光蛋白。這些修飾是通過特定位置的Cas9誘導的DSB進行的，這顯著增強了靶向整合的機會。靶向整合（基因敲入）通過HDR發生。為了通過HDR進行基因編輯，必須將含有所需序列的DNA “供體” 或修復模板與gRNA和Cas9一起遞送至細胞，通常在供體質粒或寡核苷酸上。基因敲入的效率通常低于敲除（<10％的修飾等位基因），但可用于產生范圍從單核苷酸變化至大插入物的特定修飾。

基因激活和抑制

除了作為基因組編輯工具之外，CRISPR還可以用作其他功能蛋白的靶向遞送系統。Cas9的一個獨特特征是它能夠獨立于DNA切割而結合靶DNA，因為這是Cas9機制的兩個獨立步驟。野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域：RuvC和HNH。為了在沒有切割的情況下實現結合，通過誘導點突變（SpCas9中的D10A和H840A）使兩個核酸酶結構域失活，導致核酸酶死亡的Cas9（dCas9）。當與靶向轉錄起始位點的gRNA組合時，發現單獨的dCas9足以通過阻斷轉錄起始來降低或抑制轉錄。在這一發展之后，科學家開始嘗試將轉錄抑制因子和激活因子與dCas9聯系起來。KRAB轉錄抑制結構域已經與dCas9融合，作為效應結構域介導的轉錄沉默的模式。dCas9也與轉錄激活因子和轉錄效應蛋白融合。用于激活的dCas9是廣泛流行的研究領域，并且包括諸如dCas9-VP64、dCas9_SunTag、dCas9-SAM、dCas9-RNA支架和dCas9-VPR的系統。 在我們的產品線中，我們將dCas9與人E1A相關蛋白P300的催化組蛋白乙酰轉移酶（HAT）核心結構域融合。當與靶向轉錄起始位點和增強子區域的gRNA組合時，dCas9-P300指導組蛋白乙酰化，從其異染色狀態釋放DNA，以通過天然染色體環境中的內源細胞機制上調基因表達。dCas9-P300組蛋白乙酰化方法代表了相對于dCas9-VP64或其他類似基因活化基序的獨特作用機制。

篩選

篩選可以快速調查大量候選基因或基因組位點，以參與您的途徑或感興趣的表型。池化寡核苷酸生產和大數據處理的改進，加上慢病毒遞送的效率，使研究人員能夠同時考慮數千個候選基因，無論是作為文庫還是更為集中的子集（panel）。我們將文庫定義為CRISPR克隆的全部基因組集合；而子集（panel）則是較小的基因子集。通常，子集（panel）和文庫可以以兩種形式組裝：池化（在一個管中有數千個gRNA）或排列（在96孔板中每個孔一個gRNA）。這兩種方法都能快速地為更大的問題提供答案，與過去的方法相比具有明顯的優勢，過去的老方法需要一次一個地詢問候選基因，是一個費時費力的過程。

我們提供多種篩選解決方案，包括來自Broad的池化GeCKO文庫，以及Sanger陣列全基因組慢病毒CRISPR文庫，以執行大型基因敲除篩選（8）。并且，人類和小鼠CRISPR / Cas9協同激活調控子（SAM）池化文庫亦即將推出，用于全基因組篩選轉錄激活表型！

上海峰志儀器有限公司提供便攜式熒光蛋白激發光源LUYOR-3415RG，能夠快速篩選熒光蛋白在愈傷、種子、葉片上的表達。現貨供應美國路陽、美國nightsea便攜式熒光光源，能夠篩選綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等多種熒光蛋白的表達。

CRISPR / CAS9是什么？

CRISPR / Cas9系統于1993年被發現，并且顯示在細菌和古細菌生物體內進化，作為對病毒和外來質粒的防御。天然CRISPR途徑的功能是將核酸酶靶向侵入性DNA，產生潛在致命的雙鏈斷裂（DSB）。在識別該途徑的功能后不久，來自細菌化膿性鏈球菌（SpCas9）的II型CRISPR / Cas9系統被重新利用以產生簡單但強大的分子工具，其可被編程以將核酸酶靶向特定的基因組序列。